Contenido

Temas teóricos.

Tema 1. Introducción a la biocatálisis.

Concepto de biocatálisis. Mercado y uso de biocatalizadores. Prejuicios en el uso de enzimas. Perspectiva histórica. Olas de innovación en biocatálisis. Ventajas y desventajas de los biocatalizadores. Diferentes tipos de procesos de biocatálisis. Sistemas celulares y enzimáticos: propiedades. Factores a considerar en un proceso de biocatálisis: fuente de biocatalizador y optimización del proceso.

Tema 2. Propiedades, clasificación y nomenclatura de enzimas.

Propiedades generales de las enzimas: Concepto y significado biológico, químico y práctico. Definiciones. Complejo enzima-sustrato. Disminución de la energía de activación. Estado de transición. Cofactores enzimáticos. Nomenclatura y clasificación de enzimas. Bases de datos con información enzimática.

Tema 3. Métodos para determinar la actividad enzimática y obtener enzimas.

Obtención y caracterización de enzimas. Fuentes de obtención. Técnicas para la extracción de enzimas. Purificación de enzimas. Análisis del proceso de purificación. Métodos de determinación de la actividad enzimática. Ensayos directos e indirectos, continuos y discontinuos. Velocidad inicial: concepto, determinación, representación. Unidades de actividad enzimática. Efecto de la concentración enzimática.

Tema 4. Análisis de cinética enzimática.

Cinética enzimática. Reacciones con un sustrato. Efecto de la concentración de sustrato: Ecuación de Michaelis-Menten. Estado preestacionario y estado estacionario: conceptos. Hipótesis de estado estacionario: tratamiento de Briggs-Haldane. Reacciones enzimáticas con más de un complejo intermedio enzima-sustrato. Significado de los parámetros cinéticos kcat, K_M y kcat/K_M.  Determinación de los parámetros cinéticos. Métodos con representaciones lineales: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Hanes-Woolf. Otros métodos: regresión no lineal y método directo (Eisenthal y Cornish-Bowden). Ecuación de Michaelis-Menten para reacciones reversibles: relación de Haldane.

Tema 5. Inhibición de la catálisis enzimática.

Inhibición de la catálisis enzimática: tipos de inhibidores. Inhibidores reversibles: inhibición competitiva, inhibición acometitiva y mixta (incluye inhibición no competitiva). Modelo general. Análisis gráfico de los diferentes tipos de inhibición. Determinación de constantes de inhibición. Concepto de IC₅₀ y su relación con las constantes de inhibición. Inhibición por exceso de sustrato. Discriminación entre sustratos competitivos. Inhibidores pseudoirreversibles e inhibidores irreversibles. Marcadores por afinidad. Inhibidores suicidas. Uso de inhibidores como medicinas.

Tema 6. Análisis de cinética enzimática en reacciones con más de un sustrato.

Reacciones con más de un sustrato: Notación de Cleland. Mecanismo secuencial ordenado, mecanismo secuencial estadístico, mecanismo de doble desplazamiento (ping-pong). Tratamiento matemático y análisis gráfico. Métodos para determinar el tipo de mecanismo. Intercambio isotópico y efecto isotópico.

Tema 7. Cinética de estados efímeros o fugaces ("transitorios").

Características de los métodos de cinética rápida. Métodos de mezcla: flujo continuo, flujo detenido y flujo extinto. Métodos de relajación: salto de temperatura (T-jump), salto de presión (P-jump). "Bursts" y "lags". Análisis del "Burst" de una reacción: determinación de la concentración de centros activos. Aplicación de las técnicas de cinética rápida al proceso de fijación del N2.

Tema 8. Efecto del pH y la temperatura sobre las reacciones enzimáticas.

Efecto de la temperatura sobre la cinética enzimática. Representación de Arrhenius. Enzimas de organismos extremófilos. Efectos del pH sobre la cinética enzimática. Influencia del pH en los parámetros cinéticos. Ionización de residuos esenciales. Evaluación de constantes de ionización. Identificación de los grupos ionizables implicados en los procesos de unión y catálisis. Efectos del microentorno sobre el pK. Ejemplos.

Tema 9. Cooperatividad y alosterismo.

Unión de ligandos a proteínas. Concepto y tipos de cooperatividad. Análisis de la cooperatividad. Ecuación de Adair. Ecuación de Hill. Unión de oxígeno a hemoglobina. Modelos de cooperatividad. Modelo de Monod, Wyman y Changeux. Explicación de los efectos cooperativos homótropos por el modelo MWC. Enzimas alostéricos. Sistemas K y sistemas V. Modelo de Koshland, Nemethy y Filmer. Modelo general. Ejemplo de enzima con regulación alostérica: aspartato transcarbamilasa.

Tema 10. Especificidad enzimática.

El centro activo, especificidad y estructura tridimensional. Definición de centro activo. Características del centro activo. Teorías sobre el acoplamiento entre la enzima y el sustrato. Teoría de Fisher (cerradura y llave). Teoría de Koshland ("ajuste inducido"). Hexoquinasa como ejemplo de acoplamiento inducido. Teoría de la selección conformacional. Hipótesis de unión de tres puntos. Hipótesiss que implican tensión. Estabilización del estado de transición. Evidencia que apoya la teoría del estado de transición. Anticuerpos catalíticos. Aplicaciones de anticuerpos catalíticos.

Tema 11. Estudio del centro activo.

Investigación sobre la estructura tridimensional de las proteínas: rayos X, RMN, crio microscopía electrónica. Identificación de centros de unión y catálisis. Modificación química con inhibidores irreversibles específicos. Marcadores por afinidad. Inhibidores suicidas, ejemplos con interés farmacológico. Mutagénesis dirigida. Serina-proteasas: subtilisina. Endonucleasas de restricción. Mecanismos "editoriales" y de corrección de errores: aminoacil-tRNA sintetasas.

Tema 12. Mecanismos de catálisis enzimática.

Mecanismos de catálisis. Introducción a los mecanismos de acción enzimática. Catálisis ácido-básica. Triosa fosfato isomerasa. Catálisis covalente. Serina proteasas y aminotransferasas. Catálisis con iones metálicos. Mecanismos de la alcohol deshidrogenasa y de la anhidrasa carbónica. Efecto del entorno: catálisis electrostática. Lisozima i superóxido dismutasa. Efectos de proximidad y orientación. Canalización de intermediarios. Enzimas multifuncionales. Enzimas con funciones no enzimáticas adicionales "enzimas pluriempleadas" (“moonlighting enzymes”).

Tema 13. Cofactores y ribozims.

Cofactores y ribozimas. Actividad catalítica del RNA. Tipos de ribozimas. El ribosoma es una ribozima. Significado biológico de las ribozimas. Mundo del RNA. Aplicaciones de las ribozimas.

Tema 14. Regulación de la actividad enzimática.

Regulación de la actividad enzimática. Modificación de la concentración enzimática. Regulación de la síntesis y degradación de enzimas. Mecanismos de degradación. Variación en la velocidad enzimática en función de la concentración de sustrato, producto y cofactores. Activación por precursor y retroinhibición. Significado funcional de la cooperatividad y del alosterismo. Control hormonal. Isoenzims. Polimerización-despolimerización. Unión a otras proteínas. Modificación covalente irreversible. Modificación covalente reversible. Sistemas de cascada enzimática.

Tema 15. Aplicaciones biomédicas y biotecnológicas de enzimas.

Enzimas en bioquímica clínica y biotecnología. Enzimas como agentes terapéuticos. Enzimas indicadores de patologías. Enzimas plasmáticas. Factores que afectan los niveles de enzimas plasmáticas. Ejemplos de enzimas con interés diagnóstico. Aminotransferasas. Creatina quinasa. Lactato deshidrogenasa. Indicadores de infarto de miocardio. Enzimas como reactivos en bioquímica clínica. Enzimas congénitas y errores del metabolismo, ejemplos. Enzimas en la industria. Producción a gran escala de enzimas. Aplicaciones: medicamentos, industria alimentaria, detergentes, industria textil. Enzimas inmovilizadas. Enzimas como biosensores.

Tema 16. Evolución dirigida.

Métodos para mejorar la biocatálisis. Diseño y síntesis de nuevos catalizadores. Evolución dirigida. Generación de mutantes. Selección y cribado de la actividad enzimática. Re-diseño de enzimas para modificar su termoestabilidad y enantioselectividad. Evolución adaptativa en el laboratorio.

PROBLEMAS

Habrá cinco sesiones de resolución de problemas, en las que se plantearán problemas de purificación de enzimas, determinación de parámetros cinéticos en ausencia y presencia de inhibidores, así como caracterización de mecanismos de inhibición y elucidación de los mecanismos de reacciones bi-sustrato.

Entrega de trabajos a través del Campus Virtual:

Se propondrán dos trabajos a través del Campus Virtual, que deberán ser resueltos por los equipos (de dos/tres personas) de alumnos formados al inicio del curso. Los trabajos deberán ser entregadas antes de una fecha concreta a través de la herramienta del Campus Virtual.

PRÁCTICAS

Se organizan en 2 sesiones de 4 horas en el laboratorio, una sesión de una hora en el Servicio de Análisis Químico y una sesión de tres horas en el aula de informática.

Programa: Caracterización de una enzima sobreexpresado en la levadura (Saccharomyces cerevisiae). Análisis de I'estereospecificitat de la reacción para con diferentes sustratos empleando cromatografía de gases. Determinación de los parámetros cinéticos en condiciones de estado estacionario, utilizando "software" específico.