Contenido

Tema 1. Introducción a la biocatálisis.

Concepto de biocatálisis. Mercado y utilización de los biocatalizadores. Prejuicios en la utilización de enzimas. Perspectiva histórica. Olas de innovación en la biocatálisis. Ventajas e inconvenientes de los biocatalizadores. Diferentes tipos de procesos de biocatálisis. Sistemas celulares y enzimáticos: propiedades. Factores a considerar en un proceso de biocatálisis: fuente del biocatalizador y optimización del proceso.

Tema 2. Propiedades, clasificación y nomenclatura de las enzimas.

Propiedades generales de las enzimas: Concepto y significación biológica, química y práctica. Definiciones. Complejo enzima-sustrato. Disminución de la energía de activación. Estado de transición. Cofactores enzimáticos. Nomenclatura y clasificación de las enzimas. Bases de datos con información de enzimas.

Tema 3. Métodos de determinación de la actividad enzimática y de obtención de enzimas.

Obtención y caracterización de las enzimas. Fuentes de obtención. Técnicas para la extracción de enzimas. Métodos de determinación de la actividad enzimática. Velocidad inicial: concepto, determinación, representación. Unidades de actividad enzimática. Efecto de la concentración de enzima.

Tema 4. Análisis de la cinética enzimática.

Cinética enzimática. Reacciones con un sustrato. Efecto de la concentración de sustrato: ecuación de Michaelis-Menten. Estado pre-estacionario y estado estacionario: conceptos. Hipótesis de estado estacionario: tratamiento de Briggs-Haldane. Reacciones enzimáticas con más de un complejo intermedio enzima-sustrato.

Tema 5. Determinación de los parámetros cinéticos.

Determinación de los parámetros cinéticos. Métodos con representaciones lineales: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Hanes-Woolf. Otros métodos. Significado de los parámetros cinéticos kcat, KM y kcat / KM. Ecuación de Michaelis-Menten para reacciones reversibles: relación de Haldane.

Tema 6. Inhibición de la catálisis enzimática.

Inhibición de la catálisis enzimática: tipos de inhibidores. Inhibidores reversibles: inhibición competitiva, inhibición acompetitiva y mixta (incluye la inhibición no competitiva). Modelo general. Análisis gráfico de los diferentes tipos de inhibición. Determinación de las constantes de inhibición. Concepto de IC50 y su relación con las constantes de inhibición. Inhibición por exceso de sustrato. Discriminación entre sustratos competitivos. Inhibidores pseudoirreversibles e inhibidores irreversibles. Marcadores por afinidad. Inhibidores suicidas. Utilización de inhibidores como fármacos.

Tema 7. Análisis de la cinética enzimática en reacciones con más de un sustrato.

Reacciones con más de un sustrato: notación de Cleland. Mecanismo secuencial ordenado, mecanismo secuencial estadístico, mecanismo de doble desplazamiento (ping-pong). Tratamiento matemático y análisis gráfico. Métodos para la determinación del tipo de mecanismo. Intercambio isotópico y efecto isotópico.

Tema 8. Cinética de los estados efímeros o fugaces ("transients").

Características de los métodos de cinética rápida. Métodos de mezcla: flujo continuo (“continuous flow"), flujo detenido ( "stopped-flow") y flujo extinguido ( "quenched-flow"). Métodos de relajación: salto de temperatura (T-jump), salto de presión (P-jump). Análisis del "Burst" de una reacción: determinación de la concentración de centros activos. "Bursts" y "lags".

Tema 9. Efecto del pH y de la temperatura en las reacciones enzimáticas.

Acción de la temperatura sobre la cinética enzimática. Representación de Arrhenius. Enzimas de organismos extremófilos. Efectos del pH sobre la cinética enzimática. Ionización de residuos esenciales. Influencia del pH sobre los parámetros cinéticos. Evaluación de las constantes de ionización. Identificación de los grupos ionizables implicados en los procesos de unión y catálisis. Efectos del micro entorno sobre el pK.

Tema 10. Cooperatividad y Alosterismo.

Unión de ligandos a proteínas. Concepto y tipos de cooperatividad. Análisis de la cooperatividad. Unión del oxígeno a la hemoglobina. Modelos de cooperatividad. Modelo de Monod, Wyman y Changeux. Explicación de los efectos cooperativos homotròpics por el modelo MWC. Enzimas al.lostèrics. Sistemas K y sistemas V. Modelo de Koshland, Nemethy y Filmer. Determinación del modelo de cooperatividad que sigue una determinada enzima. Ejemplo de enzima con regulación alostérica: aspartato carbamil transferasa.

Tema 11. Especificidad enzimática.

El centro activo, especificidad y estructura tridimensional. Definición de centro activo. Características del centro activo. Teorías sobre el acoplamiento entre la enzima y el sustrato. Teoría de Fisher (llave-cerradura). Teoría de Koshland (“induced fit" o acoplamiento inducido). La hexoquinasa como ejemplo deacoplamiento inducido. Hipótesis de la unión a tres puntos. Hipótesis que implican tensión. Estabilización del estado de transición. Evidencias que apoyan la teoría del estado de transición. Anticuerpos catalíticos. Aplicaciones de los anticuerpos catalíticos.

Tema 12. Estudio del centro activo.

El centro activo. Identificación de los centros de unión y de catálisis. Marcado con una parte del sustrato. Utilización de sustratos artificiales. Modificación química con inhibidores irreversibles específicos. Marcadores por afinidad. Inhibidores suicidas, ejemplos con interés farmacológico. Mutagénesis dirigida. Las serina-proteasas: subtilisina. Comparación de la mutagénesis y el marcaje químico. Investigación de la estructura tridimensional de proteínas: rayos X, RMN, modelado molecular. Endonucleasas de restricción. Mecanismos "editoriales" y de corrección de errores: aminoacil-tRNA sintetasas.

Tema 13. Mecanismos de catálisis enzimática.

Mecanismos de catálisis. Introducción a los mecanismos de la acción enzimática. Catálisis ácido-básica. Catálisis covalente. Piridoxal fosfato. Catálisis con iones metálicos. Mecanismos de la alcohol deshidrogenasa y la anhidrasa carbónica. Efecto del entorno: catálisis electrostática. El lisozima. Mecanismo de la subtilisina. La superóxido dismutasa. Efectos de proximidad y orientación. Canalización de intermediarios. Enzimas multifuncionales. Enzimas con funciones adicionales no enzimáticas "moonlighting enzymes".

Tema 14. Cofactores y ribozimas.

Cofactores y ribozimas. Actividad catalítica del RNA. Tipo de ribozimas. El ribosoma esuna ribozima. Significado biológico de las ribozimas. Aplicaciones de las ribozimas.

Tema 15. Regulación de la actividad enzimática.

Regulación de la actividad enzimática. Modificación de la concentración de enzima. Regulación de la síntesis y degradación de las enzimas. Mecanismos de degradación. Variación de la velocidad enzimática en función de la concentración de sustrato, producto y cofactores. Activación por precursor y retro inhibición. Significado funcional de la cooperatividad y el Alosterismo. Control hormonal. Isoenzimas. Polimerización-despolimerización. Unión a otras proteínas. Modificación covalente irreversible. Modificación covalente reversible. Sistemas de cascada enzimática.

Tema 16. Aplicaciones biomédicas y biotecnológicas de las enzimas.

Enzimas en bioquímica clínica y biotecnología. Enzimas como agentes terapéuticos. Enzimas indicadores de patologías. Enzimas plasmáticos. Factores que afectan los niveles de los enzimas plasmáticos. Ejemplos de enzimas con interés diagnóstico. Aminotransferasas. Creatina quinasa. Lactato deshidrogenasa. Indicadores del infarto de miocardio. Enzimas como reactivos en bioquímica clínica. Enzimas y errores congénitos del metabolismo, ejemplos. Enzimas en la industria. Producción en gran escala de enzimas. Aplicaciones: fármacos, industria alimentaria, detergentes, industria textil. Enzimas inmovilizados. Enzimas como biosensores.

Tema 17. Evolución dirigida.

Métodos para mejorar la biocatálisis. Diseño y síntesis de nuevos catalizadores. Evolución dirigida. Generación de mutantes. Selección y cribado de la actividad enzimáticadeseada. Re-diseño deenzimas para modificar su termoestabilidad y enantioselectividad. Evolución adaptativa en el laboratorio.

Resolución de problemas.

Los problemas se centran de manera especial en el análisis de la actividad enzimática y la determinación e interpretación de parámetros cinéticos. Los enunciados de los problemas se entregarán a través del Campus Virtual.